Действие игры разворачивается на территории Италии образца 1476-го года. Альтаир снят с должности главного героя и его место заменил флоренцианский представитель знати Эцио Аудиторе де Фиренце – тоже дальний родственник Десмонда, из генов которого выкачивают ценную информацию.

Леонардо да Винчи, как и несколько других исторических личностей тех времен (скажем, Николло ло Макиавелли и Катерина Сфорца), будут помогать нашему профессиональному киллеру. Да Винчи – своими невероятными изобретениями (в статье, кстати, говорится о том, что у Эцио будет сразу два «скрытых» кинжала – по штуке на каждую руку), Макиавелли – советами как убить цель "тихо и без пыли". Ну а Катерина Сфорца – просто еще один союзник на итальянской политической сцене.

Однако не все исторические персоны будут нам друзьями. Нажить врагов – задача, в общем-то, не сложная. Так, протагонисту посчастливится устроить покушение на жизнь знатного и влиятельного итальянского политика Лоренцо де Медичи.

Развивается основная часть игры в двух городах – Венеции и Флоренции. По такому случаю Ubisoft не поленилась и воссоздала многочисленные исторические места, включая чарующие венецианские водные каналы с их гондолами. Революционные изменения коснутся и мира за пределами городов. Если в первой части там делать было особо нечего, то в Assassin's Creed 2 разработчики сделали прилегающие к центрам урбанизации места более «полезными» для игроков. Тут же стоит сказать о 16 типах миссий, предлагающих теперь не только побегать по городу на время или собрать с десяток флажков, измененную систему «Известности» (скрываться от преследования будет не так просто, как в прошлой части) и паре новых трюков в активе главгероя. Он научился плавать, отбирать оружие у врагов и даже летать – правда, для этого потребуется уже гений Леонардо Да Винчи и его «летающие» машины.